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常见问题
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  • 蛋白的上样量有没有什么具体的要求?

    上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的WesternBlot 则上样量要均等,如 果只是要定性,则没有太大的关系,尽量多上就行了,但是不要超载。

  • 有什么方法可以提高上样量?

    a)可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量;

    b)用5 倍的上样缓冲液来稀释变性

  • 问大分子量蛋白200KD,在做 western 要注意什么呢?

    做 200kd 蛋白的WesternBlot 时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需 要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。

  • 做组织样品的western 的时候,怎样处理样品?

    必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑 制蛋白酶的活性(加入PMSF)。

  • 问一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?

    WesternBlot 一般上样 30-100 微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育 时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点 时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要 反复地试了,当然有的不适合 WesternBlot 的怎样做也不行。

  • 二抗是生物素化的抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否 要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是 吗?

    不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BSA代替应该好一点.

  • 我所测定的蛋白分子量是 105KD,按理说分离胶应当采用7.5%,但资料却要求分离胶和浓缩胶均 采用11%的配方,不知为何?

    上述提到的两种凝胶均可以使用,因为105KD 的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意 条带位置。

  • 蛋白变性后可以存放多久?

    -80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被 酶水解了)。

  • 如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?

    可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有 问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试 1.5mm 的。

  • 想分离的蛋白是分子量200kd的,SDS-PAGE 电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作 WesternBlot 吗?

    200kd 的蛋白不好做, 分离胶用7%,积层胶3.5%。

  • 我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1 微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜 上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?

    你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,加20%甲醇。

  • 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?

    如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂要温和得多,这时最好加上NaF 去抑制磷酸化酶 的活性。

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