TECHNICAL COLUMN
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一、鼠对鼠染色注意事项
用鼠抗体对鼠组织染色是个复杂的过程,因为容易导致背景染色高,而且很难消除。 形成这种背景主要是由于组织染色时二抗与内源性的鼠 IgG,或 B 细胞、浆细胞及巨噬细胞上的 Fc 受体结合造成的。
不能保证鼠单克隆抗体与鼠组织(除非说明书有显示)。然而,必需鼠对鼠染色时,应用一些窍门可能会有助于减少这些背景染色。
封闭内源性 IgG
1.按常规制备组织切片。
2.在封闭步骤,用血清(与二抗同种动物来源)室温封闭 30 分钟。
3.PBS-吐温-20 冲洗 3 X 2 分钟。
4.组织切片与未结合的抗鼠 IgG 的 AffiniPure Fab 片段(H+L)室温孵育 1 小时或 4°C 过夜。建议封闭抗体浓度用 0.1 mg/ml,但是否是最佳浓度仍需终端用户来评估。
5.抗体染色。
封闭内源性Fc受体
以单克隆二抗F(ab)段封闭内源性 Fc 受体,有市售试剂盒。
有助于降低背景染色的其它窍门
1.切片在含 1% Triton 的 PBS 中室温孵育 30 分钟,“清净”组织。
2.TBS–吐温-20 作为冲洗缓冲液比 PBS-吐温-20 更能减少背景染色。
二、疑难解答提示
无染色
一抗和二抗不匹配
使用针对一抗的二抗(如一抗来自兔,二抗为抗兔抗体)
没有足够的一抗与目标蛋白结合
使用低稀释度抗体。延长 4℃ 孵育时间(如过夜)。
抗体的天然结构(3D 形态)受损不适用于 IHC
用天然(非变性的)WB法检测抗体,确保抗体没被损坏。
由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效
做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。
靶组织中没有目标蛋白
参照抗体供应商的建议做阳性对照。
组织中没有足够的目标蛋白
应用信号放大操作。
没有避光保存二抗
避免将二抗处于光照下。
脱蜡不彻底
延长脱蜡时间,更换二甲苯。
固定步骤(使用福尔马林和多聚甲醛固定剂)修饰了抗体识别表位
抗原修复法暴露出抗原表位,缩短固定时间。
蛋白位于细胞核内(核蛋白),抗体不能穿透核膜
在封闭液和抗体稀释液中加入通透剂。
PBS 缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根
在抗体 PBS 储存液中加入 0.01% 叠氮化合物,或使用新鲜无菌的 PBS。
高背景
没有封闭非特异性结合或封闭不充分
延长封闭时间,并考虑改换封闭剂。Abcam 建议用 10% 正常血清封闭切片 1 小时或 1-5% BSA 封闭培养细胞 30 分钟。
一抗浓度过高
滴定法寻找到最佳抗体浓度,或在浓度较低抗体中延长孵育时间(最好是缓慢而准确地结合)。
孵育温度过高
4°C 孵育切片或细胞
二抗发生了非特异性结合(被损坏)
不加一抗,做二抗对照。
组织冲洗不彻底,有固定剂残留
所有步骤都要用 PBS 充分洗涤。
存在内源性过氧化物酶活性
用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2mM),或抑制过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
固定过度(固定剂用福尔马林和多聚甲醛)导致抗体识别抗原位点被修饰
改变抗原修复方法,缩短与抗原修复液的孵育时间。
信号过度放大(信号放大技术)
缩短信号放大孵育时间,稀释信号扩大试剂盒。
底物过量(酶检测法)
缩短底物孵育时间
染料与 PBS 在细胞/组织中相互作用(酶检测法)
用 Tris 缓冲液冲洗切片后,再与底物孵育。孵育后,Tris缓冲液再次冲洗细胞/切片。
通透作用破坏膜并除去了膜蛋白
去除缓冲液中的通透剂
非特异性染色
一抗/二抗浓度过高
降低抗体浓度和或缩短孵育周期。对比不表达目标蛋白细胞的信号强度。
存在内源性过氧化物酶活性
用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2mM),或抑制过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
一抗与被染组织同源(如用鼠一抗测鼠组织),加二抗后,二抗会与同源的所有组织结合
应用与组织非同源的一抗
切片/细胞变干
保持切片/细胞湿度,切勿变干。
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