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缓冲液和试剂
通常将未知浓度样品与阳性对照标准曲线相比较,可精确定量。每块板都要带标准(做平行或者三份)和空白对照以保证精确性。
常规程序
包被抗原
1.用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀释抗原到 PVC 微孔板上的第一排孔,按要求往后进行系列稀释。
(样品纯度较高时通常在酶标板上稀释到不低于 2μg/ml。不一定用纯化的溶液,不过,一般在试验样品中目的蛋白(抗原)含量需大于 3%。抗原的蛋白浓度在酶标板上应该不高于 20μg/ml,此时已经足够中和酶标板上的位点了。确保抗原的浓度在抗体可以检测到的范围内。)
2.在酶标板上覆盖封口膜,室温孵育 2 小时,或者 4°C 过夜。包被的孵育时间需要优化。
3.倒掉孵育溶液,用 PBS 每孔 200μl 洗板 3 次。在水池上轻甩倒掉洗液,在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。
封闭
4.用 200μl 含 5% 脱脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点。或者用其他封闭剂如 BlockACE、BSA(牛血清 蛋白)代替。
5.用封口膜覆盖酶标板室温至少孵育 2 小时,或者 4°C 过夜。
6.用 PBS 洗板 2 次
加一抗和二抗进行孵育
7.每孔加入 100μl 稀释好的一抗。
8.用封口膜覆盖酶标板室温孵育 2 小时,该孵育时间需要进行优化。尽管 2 小时的孵育通常可以获得足够强的信号,但如果获得的信号较弱时 ,通过 4°C 孵育过夜通常可以获得较强信号。
9.用 PBS 洗板 4 次。
10.加 100μl 标记二抗,稀释到最佳浓度(参照说明书),使用前用封闭液现配。
11.用封口膜覆盖酶标板室温孵育 1-2 小时。
12.用 PBS 洗板 4 次。
信号较弱时 ,通过 4°C 孵育过夜通常可以获得较强信号。
检测
虽然许多种类的酶都可以用来检测,但辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 实验中是被广泛应用的两种酶。我们
必须要考 虑到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性(例如肺泡细胞中高含量的 AP,红血球中高含量的过氧化物酶),这可
能导致不精确的结果。 如果有必要的话,用左旋咪唑(针对 AP)或含 0.3% 双氧水溶液的甲醇(针对过氧化物酶)进行一个附加
的封闭处理。
AP 底物
pNPP(对硝基苯基磷酸盐)是最广泛使用的底物。室温下孵育 15-30 分钟后,硝基酚的黄颜色可以在 405nm 下被检测出(这一反
应可以通 过加入适当量的 0.75M 氢氧化钠溶液来终止)。
HRP显色剂
HRP 的底物是过氧化氢,反应中,过氧化氢分裂使氢供体氧化产生颜色变化。
TMB (3,3’,5,5’-四甲基对二氨基联苯)
加 TMB 溶液至每孔,孵育 15-30 分钟,加相同分量终止液(2M 硫酸),在 450nm 下读取吸光度值。
OPD (邻苯二胺盐酸盐)
终产物在 492nm 下检测。需要注意的是这种底物对光敏感,因此需要避光保存。
ABTS (2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)磷酸氢二铵盐)
终产物是绿色的,在 416nm 测定吸光度值。
注意:一些酶底物是有害的(致癌物),因此必须小心操作并佩戴手套。
13. 用多通道吸液器向每孔加入 100μl(或 50μl)底物。
14. 显示出足够深的颜色之后,再向每孔加终止液 100μl(如果必须)。
15. 用酶标仪读每个孔的吸光度值(光密度)。
数据分析
根据连续稀释的数据制作一条标准曲线,x轴为浓度(对数转换),y轴为吸光度值(线性)。将样品吸光度值代入标准曲线求出浓度。
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