一、目的基因的克隆（以pshuttl-CMV质粒为例）

1.选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入 pshuttl-CMV 质粒多克隆位点。

2. 重组质粒鉴定： 酶切鉴定或测序。

3. 重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。

4. 用 PmeI 单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。

5. 胶回收线性化质粒，以备共转化使用。

二、共转化

1、大肠杆菌 BJ5183 电转感受态制备

从新鲜琼脂板上挑取单个 BJ5183 细菌，接种于 LB 培养基中，37℃振摇过夜 。接种 25ml 过夜培养物于 500ml LB 培养基，37℃振摇，至 OD600 达到 0.4。迅速将培养物置于冰浴中 30min，至充分冷却。将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以 2500r/min 离心 15 min，弃培养液，回收细胞。以 10ml 预冷的 10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。加约 1ml（适量）预冷的 10%甘油重悬沉淀，稀释悬液 100 倍，测量 OD600 ，至稀释浓度为 2-3×1010 个细胞/ ml (1.0 OD600 约 2.5×1010 个细胞/ml)。分装，-80℃或液氮保存待用。

2、病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。

3、将 1-5?l (约 1?g) 线性化的穿梭质粒及 1?l（约 100ng/?l）病毒骨架质粒（如pAdEasy-1）加入至含约 40?l BJ5183 电转感受态的 EP 管中混匀,冰上冷却。

4、将混合物加入电转杯，电击（1250-1500V/mm,5ms）。

5、电击结束取出样品，加入 1ml SOC 或 LB 培养液，37℃低速振荡 40min。

6、取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培养 16-20hr。

7、次日挑取平板上长出的菌落（选择最小的菌落）,接种于 3ml 含 25-50mg/ml的 LB 培养基，37℃培养 10-15hr。

8、碱裂法提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳筛选，大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定。以 PacI 单酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段（约30kb）,及一条小片段（约 3.0 或 4.5kb）（同时可进行其它酶切鉴定），则基本确定为阳性克隆。

9、取1-5?l 阳性质粒转化至DH5α大肠杆菌细胞（BJ5183为recA+,质粒DNA易发生突变，DH5α或JM109，XL1-blue菌株为重组缺陷性菌株，可稳定扩增已鉴定的重组质粒），扩增细菌并纯化质粒。

三、重组病毒质粒转导293细胞

1、293细胞培养：转导24小时前，以方瓶为例，接种2×106293细胞于25cm2方瓶，使生长密度约50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）

2、以PacI单酶切重组病毒质粒（转导25cm2方瓶约需4?gDNA），完全线性化后，乙醇沉淀，再以20 ?l ddH2O溶解。

3、脂质体包裹质粒（以Lipofectamine为例）:每4?g PacI约需20?l Lipofectamine包裹.质粒及脂质体分别稀释于500?l无血清培养基再混合,置于室温下15-30min。

4、以无血清培养基轻轻洗涤培养瓶，另加2.5ml无血清培养基，37℃放置10min。

5、将Lipofectamine-DNA混合物加入培养瓶，37℃孵箱放置4hr。

6、4hr后，弃Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培养基（含10%FCS）。如有大量细胞漂浮，可不弃Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培养基，37℃孵育过夜，再换液。

7、培养过程中观察细胞生长情况。约2周后可观察到细胞病变（CPE）出现（如用pAdTrack-CMV质粒，由于含GFP，可观察到绿色荧光）。

四、重组病毒鉴定

1、转导10-14d后，收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS混悬，冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃。

2、取 30-50% 步骤 1 中上清，感染 50-70%饱和度的 25cm2 方瓶中 293 细 胞 。2-3d后出现明显细胞病变。

3、感染后 3-5d,当 1/3-1/2 细胞漂浮时收集病毒。按步骤 1 收集细胞并准备病毒上清。通过 Western blot 和/或 PCR 鉴定重组腺病毒产生。

4、PCR 鉴定重组病毒。取 5?l 病毒上清加入 10?l 蛋白酶 K，55℃孵育 1hr，再煮沸 5min，离心后取 1-2?l 作 PCR。

五、重组病毒扩增，纯化

1、75cm2方瓶中接种 293 细胞，至密度达到 90%，加入适量病毒上清感染细胞。3-4d 后，细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮，则收集所有细胞。约 500g 转速离心，弃上清。

2、以灭菌 PBS 重悬沉淀，反复冻融 4 次。4℃下 7000g 离心 5min.病毒纯化至少需要 30 瓶 75cm2方瓶细胞。

3、CsCl 连续梯度离心纯化：50ml 离心管中称量 4.4g CsCl，加入 8ml 病毒裂解上清液，混匀，体积约为 10ml。转移至 12ml 超速离心管（用于 SW41 转头）中，覆盖约 2ml 矿物油。平衡后，10℃下 32000 rpm 离心 18-24hr，用注射器抽吸离心出的病毒带。（也可 CsCl 不连续梯度离心：20ml 超速离心管中缓慢加入 8ml CsCl 1.4 (53 g +87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，上面小心加入 6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，再小心加入病毒上清液至体积达到 20ml。平衡 后 ，4℃下 23000rpm 离心 90min (SW28 转头)，用注射器抽吸下层蓝白色病毒带）

4、病毒透析去盐：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 5% sucrose），灭菌处理。4℃透析，更换3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80℃。

六病毒滴度测定（TCID50）

1、细胞准备:96孔板中接种100?l 293细胞,每孔细胞数约104个,以2% DMEM培养

2、稀释病毒液准备：以2% DMEM将病毒液稀释成8个较高浓度（如10-3-10-10），每个浓度重复10个，每孔加入病毒稀释液100?l。另留两排不加病毒液作为阴性对照。37℃下，孵箱培养10天。

3、10d后观察细胞，记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率。（如某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0）。

4、计算T =10×101 + d (S - 0.5) /mld = Log 10 稀释度（如为10倍稀释℃，d=1）S = 各浓℃细胞病变比率之和实验室重组腺病毒常用质粒：病毒骨架质粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2穿梭质粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV。