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IHC/ICC 中的固定和通透技术
固定:
固定就是保持抗原细胞和亚细胞结构固定不动,同时又能使抗体进入到细胞和亚细胞的所有部位。固定和通透方法的选择取决于抗原表位和 抗体本身的灵敏性,有时需要优化。
固定时可使用一些交联试剂,如多聚甲醛,有利于保护细胞结构,但是可能会降低一些细胞成分的抗原性,因为交联阻碍了抗体结合。鉴于 此,可采用抗原修复技术,尤其是固定孵育时间较长时或使用高百分比的交联度固定剂时。另外一种选择就是使用有机溶剂,但是它们会吸 去脂类使细胞脱水,同时会使蛋白沉淀在细胞架上。
1.4% 多聚甲醛
向玻片滴加 4% 多聚甲醛,维持 10 分钟。
用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 冲洗细胞。
(注意:在多聚甲醛中固定时间超过 10-15 分钟会造成蛋白交联,或许需要通过抗原修复技术来修复此交联位点,
以确保抗体能自由结合并检测到该蛋白。)
2.乙醇
向玻片滴加 100-200μl 预冷的 95% 乙醇,5% 冰醋酸,维持 5-10 分钟。
用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 冲洗细胞。
3.甲醇
向玻片滴加 100-200μl 的冷甲醇。 -20°C 维持 10 分钟。
用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 冲洗细胞。
(注意:甲醇有通透作用。一些抗原表位对甲醇非常敏感,能破坏抗原表位结构。因此,如果需要通透,可用丙酮代替甲醇。)
4.丙酮
向玻片滴加 100-200 μl 的冷丙酮。 -20°C 维持 5-10 分钟。
用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 冲洗细胞。
(注意:丙酮也有通透作用,因此,不需要进一步通透。)
通透:
通透技术仅用于抗体需进入细胞内检测蛋白时,包括细胞内蛋白和抗原表位位于胞内区的跨膜蛋白检测。
溶剂:
1.丙酮固定也有通透作用。
2.甲醇固定也可通透,但不是总适用。
这些反应试剂都可用来固定和通透,也可在交联剂如多聚甲醛固定后再使用。
去污剂:
1.Triton 或 NP-40
含 0.1-0.2% Triton 或 NP-40 的 PBS 洗涤 10 分钟。
这些去污剂同样也能溶解部分核膜,因此非常适合于核抗原染色。
(注意:因为这些都是强去污剂,因此当使用浓度较高或作用时间较长时会破坏蛋白,影响染色效果)
2.吐温-20,皂角苷,洋地黄皂苷和 Leucoperm。
用0.2-0.5% 洗涤 10-30 分钟。
这些是较温和的细胞膜溶剂。它们会使细胞膜产生足够大的孔,促使抗体进入细胞内而不用溶解胞膜。适合于胞浆内抗原质膜的
胞浆表面抗 原和可溶的核抗原。
特别建议:
用丙酮、乙醇或甲醛(高浓度)固定细胞骨架、病毒和一些酶抗原,可获得理想的结果。
位于细胞器和胞浆颗粒上的抗原,其固定和通透方法的选择取决于抗原本身,需尽量保留表位。
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