真核细胞依赖于多种途径的膜循环，比如溶质分泌、营养吸收或膜蛋白周转。每个途径都使用几种类型的细胞器，从质膜、内质网和高尔基体到回收中间体，如载体或运输囊泡。如何确定在给定途径中起作用的不同细胞器和回收中间体的类别是一项复杂的任务。并且不同细胞器的循环膜和蛋白质标记物也需要同时识别。

为了解决上述问题，通常的做法是采用荧光团标记回收细胞器的膜并使用免疫染色技术来揭示同一细胞器上的蛋白质标记。但是由于探针容易从它们的目标细胞器中丢失，甚至可能被困在其他结构中，例如线粒体。同时，由于大量的转运细胞器彼此非常接近，这使得传统的衍射显微镜难以区分它们。

为了克服这些限制，一种新型膜探针被开发出来，称为膜结合荧光团-半胱氨酸-赖氨酸-棕榈酰基团membrane-binding fluorophore-cysteine-lysine-palmitoyl group (mCLING)，这种新型mCLING探针，由一个八肽组成，包括一个半胱氨酸和七个赖氨酸，其中一个与棕榈酰尾相连，它的分子量为 2,056D，包括 Atto647N部分。马来酰亚胺基团将半胱氨酸桥接到荧光团。

mCLING探针能标记质膜并在内吞过程中被吸收。它在固定和透化后仍然附着在膜上，因此可以与免疫染色和超分辨率显微镜结合使用。 mCLING已经得到验证的应用包括哺乳动物培养的细胞、酵母、细菌、原代培养的神经元、黑腹果蝇幼虫神经肌肉接头和哺乳动物组织。mCLING使我们能够研究不同运输细胞器的分子组成。

mCLING的标记模式与活细胞中 FM染料的标记模式相同，证实该探针确实报告了内吞作用。此外，mCLING对细胞没有毒性作用。

在 mCLING存在下，我们将这些配体应用于培养中的COS7细胞。实时荧光成像显示几乎所有含有配体的细胞器均被 mCLING 标记。重要的是，mCLING的存在不会干扰COS7细胞中的膜运输。例如，转铁蛋白摄取量不受mCLING的影响；它的回收和释放也不受影响。

如图，mCLING揭示了海马神经元中主动循环和自发循环突触小泡之间蛋白质组成的差异。

IHC 细胞器的多色免疫染色分析

mCLING探针技术，可用于标记质膜并跟踪内吞细胞器。与大多数用于膜标记的市售染料不同，mCLING可以轻松地与固定和免疫染色结合用于细胞培养和组织中。此外，据我们所知，mCLING是唯一可用于揭示微小内吞细胞器形态和身份的荧光探针。此外，超高分辨率显像也是mCLING探针一大优势。

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